КЛОНИРОВАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SHРНК, СПЕЦИФИЧНОЙ К ЭЛАСТАЗЕ МАКРОФАГОВ, В ЭКСПРЕССИОННЫЙ ВЕКТОР PGPV-17019250
Ключевые слова:
рак, эластаза макрофагов, молекулярное клонирование, экспрессионный вектор pGPV-17019250, shРНК, РНК-интерференция.
Аннотация
ВВЕДЕНИЕ: Эластаза макрофагов/ММП12 одна из ключевых матриксных металлопротеиназ, секретируемых в межклеточное пространство. После секреции и активации ММП12 участвует в протеолизе ряда белков межклеточного матрикса, таких как фибронектин, ламинин и эластин, облегчая миграцию иммунных клеток в очаг воспаления.
ЦЕЛЬ: Целью данного исследования было создание вектора, который экспрессировал бы малую ингибирующую РНК (shРНК), специфичную к эластазе макрофагов человека.
МЕТОДЫ: Для молекулярного дизайна кДНК, кодирующей shРНК, специфичную к эластазе макрофагов, использовали электронный ресурс «siRNA Wizard». Синтезированную кДНК клонировали в экспрессионный вектор pGPV-17019250, используя рестрикционные эндонуклеазы BamH1 и EcoRI, а также коммерческую Т4 ДНК лигазу. Для подтверждения результатов клонирования использовали методы ПЦР и ДНК секвенирования.
РЕЗУЛЬТАТЫ: В проведенном исследовании мы установили последовательность кДНК, которая кодирует shРНК, специфичную к эластазе макрофагов. Мы также провели ее клонирование в экспрессионный вектор pGPV-17019250 и подтвердили результаты клонирования.
ВЫВОДЫ: Нами получен экспрессионный вектор pGPV-17019250-ЭМ, предназначенный для подавления экспрессии shРНК, специфичной к эластазе макрофагов человека.
Литература
1. Mogulevtseva, JA, Mezentsev, A., Bruskin SA, The Role of Matrix Metalloproteinases in the Pathogenesis of Psoriasis // A Closer Look at Metalloproteinases. Hauppauge, NY. Nova science publishers, 2019.
2. Hunninghake GM, Cho MH, Tesfaigzi Y, et al. MMP12, lung function, and COPD in high-risk populations // N. Engl. J. Med. 2009;361(27):25992608. https://doi.org/10.1056/NEJMoa0904006.
3. Goncalves I, Bengtsson E, Colhoun HM, et al. Elevated plasma levels of MMP-12 are associated with atherosclerotic burden and symptomatic cardiovascular disease in subjects with type 2 diabetes // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2015;35(7):17231731. https://doi.org/10.1161/ATVBAHA.115.305631.
4. He H, Olesen CM, Pavel AB, et al. Tapestrip proteomic profiling of atopic dermatitis on dupilumab identifies minimally invasive biomarkers // Front. Immunol. 2020;11:1768. https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.01768.
5. Starodubtseva NL, Sobolev VV, Soboleva AG, et al. Expression of genes for metalloproteinases (MMP-1, MMP-2, MMP-9, and MMP-12) associated with psoriasis // Genetika. 2011;47(9):1254-1261.
6. Tewari A, Grys K, Kollet J, et al. Upregulation of MMP12 and its activity by UVA1 in human skin: potential implications for photoaging // J. Invest. Dermatol. 2014;134(10):2598-2609. https://doi.org/10.1038/jid.2014.173.
7. Kerkelä E, Ala-Aho R, Jeskanen L, et al. Expression of human macrophage metalloelastase (MMP-12) by tumor cells in skin cancer // J. Invest. Dermatol. 2000;114(6):1113-1119. https://doi.org/10.1046/j.1523-1747.2000.00993.x.
8. Ujfaludi Z, Tuzesi A, Majoros H, et al. Coordinated activation of a cluster of MMP genes in response to UVB radiation // Sci. Rep. 2018;8(1):2660. https://doi.org/10.1038/s41598-018-20999-6.
9. Avola R, Granata G, Geraci C, et al. Oregano (Origanum vulgare L.) essential oil provides anti-inflammatory activity and facilitates wound healing in a human keratinocytes cell model // Food. Chem. Toxicol. 2020;144:111586. https://doi.org/10.1016/j.fct.2020.111586.
10. Huth L, Marquardt Y, Heise R, et al. Bifonazole exerts anti-Inflammatory effects in human three-dimensional skin equivalents after UVB or histamine challenge // Skin Pharmacol. Physiol. 2019;32(6):337-343. https://doi.org/10.1159/000502213.
11. Swindell WR, Bojanowski K, Chaudhuri RK. A zingerone analog, acetyl zingerone, bolsters matrisome synthesis, inhibits matrix metallopeptidases, and represses IL-17A target gene expression // J. Invest. Dermatol. 2020;140(3):602-614.e15. https://doi.org/10.1016/j.jid.2019.07.715.
12. Swindell WR, Bojanowski K, Chaudhuri RK. A standardized Terminalia chebula fruit extract alters the expression of genes associated with skin architecture and barrier formation // Eur. J. Dermatol. 2020;30(5):469-492. https://doi.org/10.1684/ejd.2020.3882.
13. Chung JH, Seo JY, Lee MK., et al. Ultraviolet modulation of human macrophage metalloelastase in human skin in vivo // J. Invest. Dermatol. 2002;119(2):507-12. https://doi.org/10.1046/j.1523-1747.2002.01844.x.
14. NCBI Nucleotide / The official website of National center for biotechnology information. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/.
15. Ren Y, Gong W, Zhou H, et al. siRecords: a database of mammalian RNAi experiments and efficacies // Nucleic Acids Res. 2009;37(Database issue):D146-149.
16. blastn suite / The official website of National center for biotechnology information. URL: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE =BlastSearch.
17. Kibbe WA. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator // Nucleic Acids Res. 2007.35(Web Server issue):W43-46.
18. siRNA Wizard / The official website of Invivogen https://www.invivogen.com/sirnawizard/.
19. Vogelstein B, Gillespie D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979;76(2):615-619.
20. Huff JP, Grant BJ, Penning CA, Sullivan KF Optimization of routine transformation of Escherichia coli with plasmid DNA // Biotechniques. 1990;9(5): 570-577.
21. Rueden CT, Schindelin J, Hiner MC, et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data // BMC Bioinformatics. 2017;18:529.
23. Churg A, Wang RD, Tai H, et al. Macrophage metalloelastase mediates acute cigarette smoke-induced inflammation via tumor necrosis factor-alpha release // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2003;167(8):1083-1089. https://doi.org/10.1164/rccm.200212-1396OC.
24. Могулевцева Ю., Мезенцев A.В. Клонирование последовательности малой ингибирующей РНК, специфичной к металлопротеиназе 1 человека, в экспрессионный вектор pGPV-17019250 // Wschodnioeuropejskie Czasopismo Naukowe. 2016. №9. Ч.1. C.85-92. [Mogulevtseva J, Mezentsev AV. Cloning of small interference RNA specific to human metalloproteinase 1 into the expression vector pGPV-17019250. Wschodnioeuropejskie Czasopismo Naukowe. 2016;(9).Pt.1:85-92. (in Russ)]
25. Могулевцева Ю., Мезенцев A.В. Молекулярный дизайн и клонирование контрольной РНК для проведения экспериментов по РНК-интерференции интерстициальной коллагеназы человека // Развитие современной науки: теоретические и прикладные аспекты. 2016. №6. С.70-77. [Mogulevtseva J, Mezentsev AV. Molecular design and cloning of scramble RNA to conduct experiments on silencing the human interstitial collagenase. Progress in modern science: theoretical and applied aspects. 2016;(6):70-77.]
26. Mogulevtseva JA, Mezentsev AV. Cloning a sequence of small hairpin RNA directed to human gelatinase B into the expression vector pGPV17019250. Wschodnioeuropejskie Czasopismo Naukowe. 2019;(44).Pt.1.32-38.
27. Mogulevtseva JA, Mezentsev AV. Molecular design and cloning of scrambled smallhairpin RNA for knocking down human gelatinase B // The Eurasian Union of Scientists. 2019;5(62).Pt.4:17-23. https://doi.org/10.31618/ESU.2413-9335.2019.4(62):111.
2. Hunninghake GM, Cho MH, Tesfaigzi Y, et al. MMP12, lung function, and COPD in high-risk populations // N. Engl. J. Med. 2009;361(27):25992608. https://doi.org/10.1056/NEJMoa0904006.
3. Goncalves I, Bengtsson E, Colhoun HM, et al. Elevated plasma levels of MMP-12 are associated with atherosclerotic burden and symptomatic cardiovascular disease in subjects with type 2 diabetes // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2015;35(7):17231731. https://doi.org/10.1161/ATVBAHA.115.305631.
4. He H, Olesen CM, Pavel AB, et al. Tapestrip proteomic profiling of atopic dermatitis on dupilumab identifies minimally invasive biomarkers // Front. Immunol. 2020;11:1768. https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.01768.
5. Starodubtseva NL, Sobolev VV, Soboleva AG, et al. Expression of genes for metalloproteinases (MMP-1, MMP-2, MMP-9, and MMP-12) associated with psoriasis // Genetika. 2011;47(9):1254-1261.
6. Tewari A, Grys K, Kollet J, et al. Upregulation of MMP12 and its activity by UVA1 in human skin: potential implications for photoaging // J. Invest. Dermatol. 2014;134(10):2598-2609. https://doi.org/10.1038/jid.2014.173.
7. Kerkelä E, Ala-Aho R, Jeskanen L, et al. Expression of human macrophage metalloelastase (MMP-12) by tumor cells in skin cancer // J. Invest. Dermatol. 2000;114(6):1113-1119. https://doi.org/10.1046/j.1523-1747.2000.00993.x.
8. Ujfaludi Z, Tuzesi A, Majoros H, et al. Coordinated activation of a cluster of MMP genes in response to UVB radiation // Sci. Rep. 2018;8(1):2660. https://doi.org/10.1038/s41598-018-20999-6.
9. Avola R, Granata G, Geraci C, et al. Oregano (Origanum vulgare L.) essential oil provides anti-inflammatory activity and facilitates wound healing in a human keratinocytes cell model // Food. Chem. Toxicol. 2020;144:111586. https://doi.org/10.1016/j.fct.2020.111586.
10. Huth L, Marquardt Y, Heise R, et al. Bifonazole exerts anti-Inflammatory effects in human three-dimensional skin equivalents after UVB or histamine challenge // Skin Pharmacol. Physiol. 2019;32(6):337-343. https://doi.org/10.1159/000502213.
11. Swindell WR, Bojanowski K, Chaudhuri RK. A zingerone analog, acetyl zingerone, bolsters matrisome synthesis, inhibits matrix metallopeptidases, and represses IL-17A target gene expression // J. Invest. Dermatol. 2020;140(3):602-614.e15. https://doi.org/10.1016/j.jid.2019.07.715.
12. Swindell WR, Bojanowski K, Chaudhuri RK. A standardized Terminalia chebula fruit extract alters the expression of genes associated with skin architecture and barrier formation // Eur. J. Dermatol. 2020;30(5):469-492. https://doi.org/10.1684/ejd.2020.3882.
13. Chung JH, Seo JY, Lee MK., et al. Ultraviolet modulation of human macrophage metalloelastase in human skin in vivo // J. Invest. Dermatol. 2002;119(2):507-12. https://doi.org/10.1046/j.1523-1747.2002.01844.x.
14. NCBI Nucleotide / The official website of National center for biotechnology information. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/.
15. Ren Y, Gong W, Zhou H, et al. siRecords: a database of mammalian RNAi experiments and efficacies // Nucleic Acids Res. 2009;37(Database issue):D146-149.
16. blastn suite / The official website of National center for biotechnology information. URL: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE =BlastSearch.
17. Kibbe WA. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator // Nucleic Acids Res. 2007.35(Web Server issue):W43-46.
18. siRNA Wizard / The official website of Invivogen https://www.invivogen.com/sirnawizard/.
19. Vogelstein B, Gillespie D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979;76(2):615-619.
20. Huff JP, Grant BJ, Penning CA, Sullivan KF Optimization of routine transformation of Escherichia coli with plasmid DNA // Biotechniques. 1990;9(5): 570-577.
21. Rueden CT, Schindelin J, Hiner MC, et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data // BMC Bioinformatics. 2017;18:529.
23. Churg A, Wang RD, Tai H, et al. Macrophage metalloelastase mediates acute cigarette smoke-induced inflammation via tumor necrosis factor-alpha release // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2003;167(8):1083-1089. https://doi.org/10.1164/rccm.200212-1396OC.
24. Могулевцева Ю., Мезенцев A.В. Клонирование последовательности малой ингибирующей РНК, специфичной к металлопротеиназе 1 человека, в экспрессионный вектор pGPV-17019250 // Wschodnioeuropejskie Czasopismo Naukowe. 2016. №9. Ч.1. C.85-92. [Mogulevtseva J, Mezentsev AV. Cloning of small interference RNA specific to human metalloproteinase 1 into the expression vector pGPV-17019250. Wschodnioeuropejskie Czasopismo Naukowe. 2016;(9).Pt.1:85-92. (in Russ)]
25. Могулевцева Ю., Мезенцев A.В. Молекулярный дизайн и клонирование контрольной РНК для проведения экспериментов по РНК-интерференции интерстициальной коллагеназы человека // Развитие современной науки: теоретические и прикладные аспекты. 2016. №6. С.70-77. [Mogulevtseva J, Mezentsev AV. Molecular design and cloning of scramble RNA to conduct experiments on silencing the human interstitial collagenase. Progress in modern science: theoretical and applied aspects. 2016;(6):70-77.]
26. Mogulevtseva JA, Mezentsev AV. Cloning a sequence of small hairpin RNA directed to human gelatinase B into the expression vector pGPV17019250. Wschodnioeuropejskie Czasopismo Naukowe. 2019;(44).Pt.1.32-38.
27. Mogulevtseva JA, Mezentsev AV. Molecular design and cloning of scrambled smallhairpin RNA for knocking down human gelatinase B // The Eurasian Union of Scientists. 2019;5(62).Pt.4:17-23. https://doi.org/10.31618/ESU.2413-9335.2019.4(62):111.
Опубликован
2021-08-11
Как цитировать
Bondar , V., и A. Mezencev. 2021. «КЛОНИРОВАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SHРНК, СПЕЦИФИЧНОЙ К ЭЛАСТАЗЕ МАКРОФАГОВ, В ЭКСПРЕССИОННЫЙ ВЕКТОР PGPV-17019250 ». EurasianUnionScientists, август, 29-36. https://doi.org/10.31618/ESU.2413-9335.2021.1.88.1414.
Выпуск
Раздел
Статьи
CC BY-ND
Эта лицензия позволяет свободно распространять произведение, как на коммерческой, так некоммерческой основе, при этом работа должна оставаться неизменной и обязательно должно указываться авторство.
