МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ДИЗАЙН И КЛОНИРОВАНИЕ КОНТРОЛЬНОЙ РНК ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТОВ ПО РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ ЭЛАСТАЗЫ МАКРОФАГОВ ЧЕЛОВЕКА
Аннотация
Изменения в экспрессии матриксной металлопротеиназы 12 (ММП12/MMP12) имеют важное
клиническое значение. Повышение экспрессии MMP12 происходит при ожогах. Оно также сопровождает
образование келоидных рубцов. При псориазе и герпетиформном дерматите Дюринга экспрессия MMP12
предшествует перестройке микрокапилляров дермы. Кроме того, высокий уровень ММП12 – один из
наиболее важных прогностических факторов при лечении меланомы. Целью проведенного нами
исследования было разработать вектор для экспрессии малой ингибирующей РНК (small hairpin
RNA/shРНК), который можно было бы использовать в качестве негативного контроля в экспериментах по
РНК-интерференции MMP12 человека. Сравнение альтернативных последовательностей контрольной
shРНК проводили при помощи общедоступных электронных ресурсов: “OligoCalc”, “Blastn suite” и
“Palindromic Sequences Finder”. Двухцепочечную ДНК, которая кодирует выбранную последовательность
shРНК, получали методом горячего отжига комплементарных одноцепочечных олигонуклеотидов.
Полученный двухцепочечный олигонуклеотид клонировали в экспрессионный вектор pGPV-17019250 по
сайтам связывания рестрикционных эндонуклеаз (EcoRI и BamH1), используя T4 ДНК лигазу. В ходе
проведенных исследований нами была отобрана последовательность ДНК, которая кодировала
контрольную shРНК, и получен вектор pGPV-17019250-MMP12c для ее экспрессии в клетках человека.
Нами были также получены доказательства того, что клонированная последовательность shРНК обладает
всеми необходимыми свойствами для проведения экспериментов по РНК-интерференции MMP12
человека. В представленной работе получен экспрессионный вектор pGPV-17019250-MMP12c для
экспрессии контрольной shРНК. Экспрессионный вектор pGPV-17019250-MMP12c предназначен для
проведения экспериментов по РНК-интерференции MMP12 человека.
Литература
2. Stawski L, Haines P, Fine A, Rudnicka L, Trojanowska M. MMP-12 deficiency attenuates angiotensin II-induced vascular injury, M2 macrophage accumulation, and skin and heart fibrosis // PLoS One. 2014. V. 9. № 10. e109763.
3. Zhang Z, Zhu S, Yang Y, Ma X, Guo S. Matrix metalloproteinase-12 expression is increased in cutaneous melanoma and associated with tumor aggressiveness // Tumour Biol. 2015. V. 36. № 11. P. 8593 – 8600.
4. Mogulevtseva, J.A., Mezentsev, A., Bruskin S.A., The Role of Matrix Metalloproteinases in the Pathogenesis of Psoriasis, in A Closer Look at Metalloproteinases. Hauppauge, NY. Nova science publishers, 2019.
5. Koolwijk P, Sidenius N, Peters E, Sier C.F., Hanemaaijer R, Blasi F., van Hinsbergh V.W. Proteolysis of the urokinase-type plasminogen activator receptor by metalloproteinase-12: implication for angiogenesis in fibrin matrices // Blood. 2001. V. 97. № 10. P. 3123 – 3131.
6. Vogelstein B., Gillespie D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76. № 2. P. 615 – 619.
7. Bertani G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems // J. Bacteriol. 2004. V. 186. № 3. P. 595 – 600.
8. Hammond M. P., Birney E. Genome information resources – developments at Ensembl // Trends Genet. 2004. V. 20. № 6. P. 268 – 272.
9. Bondar' V., Mezencev A.V. Klonirovanie posledovatel'nosti shRNK, specifichnoj k jelastaze makrofagov, v jekspressionnyj vektor pGPV-17019250 // Evrazijskij Sojuz Uchenyh. Serija: medicinskie, biologicheskie i himicheskie nauki. 2021. № 7. S. 29–36.
10. Online Application to design scrambled sequence [Electronic resource]. URL: https://www.genscript.com/ssl-bin/app/scramble (Accessed at 18.01.2022).
11. Scrambled siRNA [Electronic resource]. URL: http://www.invivogen.com/sirnawizard/scrambled.php (Accessed at 18.01.2022).
12. Oligo Calc [Electronic resource]. URL: http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html (Accessed at 18.01.2022).
13. blastn suite [Electronic resource]. URL: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE =BlastSearch (Accessed at 18.01.2022).
14. Palindromic Sequences Finder [Electronic resource]. URL: https://www.novoprolabs.com/tools/dna-palindrome (Accessed at 18.01.2022).
15. Design hairpin insert [Electronic resource]. URL: https://www.invivogen.com/sirnawizard/construct.php (Accessed at 18.01.2022).
16. Kristen A.V., Ajroud-Driss S., Conceição I., Gorevic P., Kyriakides T., Obici L. Patisiran, an RNAi therapeutic for the treatment of hereditary transthyretin-mediated amyloidosis. // Neurodegener Dis. Manag. 2019. V. 9. № 1. P. 5-23.
17. Geall A.J., Verma A., Otten G.R., Shaw C.A., Hekele A., Banerjee K., Nonviral delivery of selfamplifying RNA vaccines // Proc Natl Acad Sci U S A. 2012. V. 109. № 36. P. 14604 – 14609.
18. Bogenhagen D.F., Prinz K.G. The action of DNA ligase at abasic sites in DNA // J. Biol Chem. 1998. V. 273. № 14. P. 7888-7893.
19. Green, M.R., Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 4th ed. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012. P. 235-239
CC BY-ND
Эта лицензия позволяет свободно распространять произведение, как на коммерческой, так некоммерческой основе, при этом работа должна оставаться неизменной и обязательно должно указываться авторство.
